Desenvolvimento de um biobanco de Plasmodium vivax para ensaios funcionais ex vivo

Malaria Journal volume 22, Número do artigo: 250 (2023) Citar este artigo

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O Plasmodium vivax é a segunda causa mais prevalente de malária, mas continua a ser difícil de estudar devido à falta de um sistema de cultura in vitro contínuo, destacando a necessidade de estabelecer um biobanco de isolados clínicos com múltiplos congelamentos por amostra para utilização em ensaios funcionais. Diferentes métodos de criopreservação de isolados de parasitas foram comparados e posteriormente o mais promissor foi validado. O enriquecimento de parasitas em estágio inicial e tardio e a maturação do parasita foram quantificados para facilitar o planejamento do ensaio.

Para comparar os protocolos de criopreservação, nove isolados clínicos de P. vivax foram congelados com quatro misturas à base de glicerólito. A recuperação do parasita pós-descongelamento, pós-enriquecimento com KCl-Percoll e em cultura in vitro de curto prazo foi medida através de microscopia de lâmina. O enriquecimento de parasitas em estágio avançado por triagem de células ativadas magnéticas (MACS) foi medido. O armazenamento de parasitas a curto e longo prazo a -80 ° C ou nitrogênio líquido também foi comparado.

Das quatro misturas de criopreservação, uma mistura (glicerólito:soro:RBC na proporção de 2,5:1,5:1) resultou em melhora na recuperação do parasita e aumento estatisticamente significativo (P <0,05) na sobrevivência do parasita em cultura in vitro de curto prazo. Um biobanco de parasitas foi posteriormente gerado usando este protocolo, resultando em uma coleção de 106 isolados clínicos, cada um com 8 frascos. A qualidade do biobanco foi validada medindo vários fatores de 47 degelos: a redução média da parasitemia pós-descongelamento (25,3%); a média de enriquecimento após KCl-Percoll (6,65 vezes); e a percentagem média de recuperação de parasitas (22,0%, medida a partir de 30 isolados). Durante a cultura in vitro de curto prazo, a maturação robusta de parasitas em estágio anelar para estágios posteriores (> 20% de trofozoítos, esquizontes e gametócitos) foi observada em 60,0% dos isolados em 48 h. O enriquecimento de estágios maduros de parasitas via MACS apresentou boa reprodutibilidade, com média de 30,0% de parasitemia pós-MACS e média de 5,30 × 105 parasitas/frasco. Finalmente, o efeito da temperatura de armazenamento foi testado, e não foram observados grandes impactos do armazenamento de curto prazo (7 dias) ou longo prazo (7-10 anos) a -80 ° C na recuperação, enriquecimento ou viabilidade do parasita.

Aqui, um método de congelamento otimizado para isolados clínicos de P. vivax é demonstrado como modelo para a geração e validação de um biobanco de parasitas para uso em ensaios funcionais.

Plasmodium vivax é a espécie de parasita da malária com maior distribuição geográfica e é responsável pela segunda maior carga de malária em todo o mundo. Embora a incidência total de P. vivax tenha diminuído globalmente de 20,5 milhões de casos em 2000 para 4,9 milhões de casos em 2021 [1], permanecem obstáculos significativos nos esforços para erradicar este patógeno, incluindo a falta de uma vacina contra P. vivax e o aumento da resistência a medicamentos antimaláricos.

A pesquisa sobre a biologia fundamental do P. vivax tem sido severamente limitada devido à falta de um sistema contínuo de cultura in vitro [2,3,4]. Esta falta de cultura contínua exige o uso de isolados clínicos de P. vivax para investigações experimentais, e o acesso limitado a estes isolados tem dificultado o progresso no avanço do conhecimento sobre este parasita. Recentemente, foram estabelecidas abordagens de cultura in vitro de curto prazo para P. vivax (incluindo em alguns casos o uso de isolados criopreservados) [3, 5, 6], tornando possível realizar ensaios de resistência a medicamentos de ciclo único [3, 7] bem como ensaios de invasão para avaliar o tropismo dos reticulócitos do hospedeiro [8], os efeitos dos anticorpos inibidores da invasão [9,10,11,12,13,14,15,16] e mutantes do receptor do hospedeiro [17, 18]. Há um reconhecimento crescente da importância do biobanco de amostras de doenças infecciosas [19,20,21], incluindo Plasmodium falciparum [22,23,24]. A geração de um biobanco de isolados criopreservados de P. vivax que possam ser descongelados de forma confiável para experimentação posterior (ensaios funcionais, ensaios de expressão gênica, genômica) seria um recurso crítico para novos avanços no campo [4].

0.01% were included for further analysis. The blood was centrifuged at 800g for 5 min at room temperature, and serum from each isolate was separated and stored at − 80 °C for related studies. The pelleted blood was washed using phosphate buffered saline (Thermo Fisher Scientific, USA, #J61196.AP) supplemented with 0.5% (w/v) bovine serum albumin (Millipore Sigma USA, #10735086001) to separate any leftover serum components. Prior to cryopreservation, the pelleted blood was separated from leukocytes, by running the sample through CF-11 column filters prepared in the lab. Smears were prepared post processing with CF-11 to assess parasite stages and to examine the leukocyte removal. De-leukocyted samples were cryopreserved using Glycerolyte 57 (Baxter/Fenwal USA, #4A7833), added as follows: glycerolyte 57:serum:RBC ratio was 2:0:1 for mixture 1 [7], 2.5:1.5:1 for mixture 2 [35, 39], 1.66:0:1 for mixture 3 [36] and 4.15:1.5:1 for mixture 4. Samples were stored in cryovials (Fisher Scientific USA, #50001020) at − 80 °C for 24 h prior to long-term storage in liquid nitrogen cryo-tanks at − 196 °C. The serum used in the study was heat-inactivated AB + pooled plasma (Access Biologicals, USA, #A17054) collected from a non-malaria endemic region./p> 80% are infected with P. vivax [42]. The ability to collect this number of P. vivax isolates has made GMC a unique setting to develop a biobank of cryopreserved parasites for future experimentation. From 2012 to 2016, over 700 P. vivax isolates were cryopreserved using the method from Kosaisavee et al. [7], where a 2:1 ratio of the cryoprotectant glycerolyte:RBCs was used. Other ratios of glycerolyte:RBCs have been reported in the literature for cryopreservation of both P. falciparum and P. vivax (Additional file 1: Table S1). Four cryopreservation mixtures, derived from established cryopreservation protocols [7, 34, 36, 39], (Fig. 1A) that varied in the ratios of glycerolyte:RBCs (with or without the addition of serum) were tested in order to identify any differences from the established 2:1 glycerolyte:RBC ratio./p> 50%) of either immature parasites (early and late rings) or maturing parasites (trophozoites, schizonts and gametocytes) (Fig. 3B). Post enrichment, all isolates had at least 20% immature parasites. At 24 h, 57.9% (11/19) had > 20% mature stages, and a subset of 26.3% (5/19) had > 50% mature stages. These proportions did not change appreciably as by 48 h, 60% of isolates (12/20) had > 20% mature stages with 30% (6/20) having > 50% mature stages./p> 0.2% parasitaemia [3]) was demonstrated (Fig. 1C). The measured recovery of parasites using this method is still relatively low (Fig. 1E), suggesting that other improvements to this approach may be possible. Future experiments should also directly measure the recovery of reticulocytes (both uninfected and infected) as well as the effectiveness of recovery and maturation of sexual stages [49], which may be useful for future transmission studies./p>

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